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在尼康A1多光子显微镜系统上实现的PLIM采集

伊利诺伊州香槟 - November 30, 2021 - 磷光在生物医学研究有许多应用前景。磷光探针可以被设计以响应环境参数，例如组织O2浓度。与拥有纳秒级寿命的荧光探针相比，这些探针的衰减寿命通常在微秒至毫秒范围内。因此，磷光寿命的测量需要以低重复率运作的激发光源。

在此之前ISS推出了磷光寿命成像 (PLIM) 模块，这与重复率低至1 Hz的激发源相兼容。最近ISS开发了新的模块，这使得以80-100 MHz重复率运作的钛蓝宝石飞秒振荡器能被用于PLIM，这通常在双光子 (2P) 显微镜中使用。这款全新的模块与尼康A1 2P显微镜相结合，能够测量100 ns至100 ms范围内的寿命测量。

氧气能猝灭探针Oxyphor 2P (由磷光猝灭氧成像中心友情提供，NIH拨款：U24-EB028941，首席研究员：宾夕法尼亚大学的Sergei Vinogradov博士)的磷光[1]。当该探针被射入组织时，氧气浓度可以用双光子激发磷光技术 [2-4] 以微米级分辨率在组织表面600µm以下的深度实现氧浓度的成像。作为原理的演示，探针被全身注射到麻醉状态下的小鼠内，吸入氧气混合物的氧浓度在15%和100%之间变化。通过颅窗利用在960 nm处发射的激光以实现大脑皮层内的双光子PLIM。磷光通过GaAs PMT和FastFLIM卡被探测。Oxyphor 2P的衰减时在~9-38 µs的范围内改变，定量反映了脑组织氧合的变化。整个过程遵循了所有的IACUC机构指南。[由NIH的拨款NS083858资助 (首席研究员：奥古斯塔大学佐治亚医学院的Sergei Kirov博士).]

2-photon image of the mouse brain surface vasculature using 70kD Texas Red dextran dye
图1. 老鼠大脑表面脉管系统的双光子成像，用到了70kD Texas Red右旋糖酐染料以标记血浆。PO2数值是在容器中心在单点处测量的。利用960 nm处的激发创建了血管造影照片，并且记录了以605 nm为中心的Texas Red荧光发射。比例尺100µm。
Phosphorescence of Oxyphor 2P as a function of oxygen concentration.
图2. Oxyphor 2P的磷光O2浓度的函数关系。探针的衰减时在9 - 38 µs的范围内变化。

图片由J. Sword博士 (位于佐治亚州奥古斯塔市的佐治亚医学院奥古斯塔大学医学中心) 提供

ISS尼康A1 FLIM和PLIM升级套件为以下技术提供了解决方案：

  • FFS (FCS、PCH、RICS和N&B)
  • 扫描FCS
  • FLIM/FRET
  • PLIM
  • 轨道粒子追踪

参考文献：

  1. Esipova, T. V.; Barrett, M. J. P.; Erlebach, E.; Masunov, A. E.; Weber, B.; Vinogradov, S. A.;
    Oxyphor 2P: A High-Performance Probe for Deep-Tissue Longitudinal Oxygen Imaging.
    Cell Metabolism 2019, 29 (3), 736-744.
  2. Finikova, O. S.; Lebedev, A. Y.; Aprelev, A.; Troxler, T.; Gao, F.; Garnacho, C.; Muro, S.; Hochstrasser, R. M.; Vinogradov, S. A.;
    Oxygen Microscopy by Two-Photon-Excited Phosphorescence.
    ChemPhysChem 2008, 9 (12), 1673-1679.
  3. Sakadzic, S.; Roussakis, E.; Yaseen, M. A.; Mandeville, E. T.; Srinivasan, V. J.; Arai, K.; Ruvinskaya, S.; Devor, A.; Lo, E. H.; Vinogradov, S. A., Boas D. A.;
    Two-Photon High-Resolution Measurement of Partial Pressure of Oxygen in Cerebral Vasculature and Tissue.
    Nature Methods 2010, 7 (9), 755-U125.
  4. Lecoq, J.; Parpaleix, A.; Roussakis, E.; Ducros, M.; Houssen, Y. G.; Vinogradov, S. A.; Charpak, S.;
    Flow Simultaneous Two-Photon Imaging of Oxygen and Blood in Deep Cerebral Vessels.
    Nature Medicine 2011, 17 (7), 893-U262.

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