Overview of Evident (奥林巴斯)
在过去的几年中，许多方法被设计出以通过光学显微镜 (STED, PALM, STORM) 获得细胞特征的纳米分辨率图像。尽管这些方法很强大，它们在探测图像中的稀疏纳米结构时效率较低。另外它们不能够检测纳米量级3D结构中以亚秒级时间发生的化学反应的动力学，它们不停地移动并改变形状
有了超分辨率的纳米成像方法，激光光束不会像光栅图像那样按已定图案扫描样品。相反，激光扫描成像是基于反馈算法，其中激光光束遵从的路径会在扫描期间不停地改变，由成像物体的形状决定。该算法将激光光斑移动到距物体表面固定距离处，因为激光光斑的位置和它到表面的距离为已知参数，它们被用于重新构建物体的形状。3D细胞结构可以在几秒钟内被分辨至20 - 40 nm，精确度为2 nm。
它是如何运作的
使用SMT纳米成像的操作顺序非常容易理解：首先，获取一个目标区域的共焦图像；然后，由用户来识别要成像的物体。SMT纳米成像通过开关激活，并且激光束被放置在离开物体中心100 - 200 nm处。当激光光斑接近要成像的表面时，荧光数量增加。但是，荧光的增加取决于距离以及荧光团的浓度与它们相应的量子产率。为了能分辨距离和浓度造成的影响，光斑的距离被迫垂直于表面振荡。换句话说，荧光强度在振荡期间改变 (图1)。
调制函数定义为交替部分和表面局部荧光造成的平均部分两者之间的比例。事实上，调制是PSF空间导数和强度之比。作为一个距表面距离的函数，调制函数以准线性增加，并且这一特点使它可用于获得激光光斑沿轨道离开表面的距离。通过这种方法，可以计算并重建该物体的横断面形状。
Product Specifications for Evident (奥林巴斯)
追踪方式
- 使用振镜的XY轴
- 使用压电控制台的Z轴
最大分辨率
- 20 nm ± 2 nm
数据采集频率
- 32至256 KHz
圆周轨道频率
- 2 KHz
探测器
- 内部PMT
探测电子元件
- ISS光子计数单元
电脑
- 高性能处理器，32 GB RAM, Windows 10, 64比特
- 32"显示器，2556 x 1440分辨率
采集和分析软件
- Globals Unlimited的SimFCS
ISS的VistaVision
产品资源
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“Measurement of distance with the nanoscale precise imaging by rapid beam oscillation method.” Lanzano, L. & Gratton, E. Microscopy Research and Technique, 75(9), pp. 1253–1264, 2012, Apr. doi: 10.1002/jemt.22058. -
“Nanometer-scale imaging by the modulation tracking method.” Lanzano, L., Digman, M.A., Fwu, P., Giral, H., Levi, M. & Gratton, E. Journal of Biophotonics, 4(6), pp. 415–424, 2011, Apr. doi: 10.1002/jbio.201100002.
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“Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking.” Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bräuchle, C., Gratton, E. & Lamb, D.C. ChemPhysChem, 10(14), pp. 2458–2464, 2009, Oct. doi: 10.1002/cphc.200900436.
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“Real-time multi-parameter spectroscopy and localization in three-dimensional single-particle tracking.” Hellriegel, C. & Gratton, E. Journal of The Royal Society Interface, 6(suppl_1), 2008, Aug. doi: 10.1098/rsif.2008.0313.focus.
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“Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two-photon microscope.” Kis-Petikova, K. & Gratton, E. Microscopy Research and Technique, 63(1), pp. 34–49, 2003. doi: 10.1002/jemt.10417.
奥林巴斯3D纳米成像单分子追踪LSM升级
下图是纳米成像单元和其与共焦显微镜连接的示意图。它带一个开关元件让用户能在标准运作模式下操作共焦显微镜，或是激活纳米成像系统。当进行纳米成像操作时，显微镜系统的振镜通过ISS提供的电子设备被操控。信号被显微镜的内部探测器收集并转移到ISS的光子计数数据采集单元。XY平面上的分子追踪可以利用显微镜系统的电流操控振镜实现；z轴上的追踪则可以通过压电控制台完成。仪器控制、数据采集和显示都是在另一个单独的电脑上完成的。
